Анна д'Эсте родилась 16 ноября 1531 года в Ферраре. Она была дочерью Эрколе II д'Эсте, герцога Феррарского и Моденского и принцессы Рене Французской. Анна получила блестящее образование. Он умела писать на итальянском, знала латинский и древнегреческий, математику и астрономию, историю и географию, музыку и танцы. В 1548 году её обручили с Франсуа Лотарингским, герцог Омальским, сыном Клода де Гиза, герцога Лотарингского. После длительных переговоров 28 сентября того же года, был подписан брачный контракт. Молодая невеста приехала во Францию, в сопровождении своей матери и сестер из Мантуи. 28 октября они прибыли в Гренобль, где их встретил отец жениха. Венчание состоялось 16 декабря 1548 года в Сен-Жермен-ан-Ле близ Парижа. В 1549 году Анна родила сына Анри де Гиза.
Со стороны матери Анна д'Эсте приходилась родственницей королю Генриху II Французскому и его сыновьям, а благодаря своему браку стала членом влиятельной семьи де Гиз. Ее итальянское происхождение связало молодую герцогиню особым образом с королевой Екатериной Медичи. В 1550 году Франсуа и Анна стали герцогом и герцогиней Лотарингскими, и вместе со свекровью, вдовствующей герцогиней Антонией де Бурбон, активно участвовала в судьбе рода де Гиз. В то же время она выполняла роль посредника между монаршими дворами Франции и Феррары, продвигая интересы своего отца.
В феврале 1563 года Франсуа I де Гиз был убит. Его убийца вскоре был схвачен и казнен. Анна д'Эсте обвинила в организации убийства мужа Гаспара де Колиньи, лидера гугенотов. В течение трех лет она требовала от короля и его двора привлечь его к ответственности. В январе 1566 года Совет короля признал Гаспара де Колиньи невиновным в организации убийства герцога Лотарингского. Утром 22 августа 1572 года на него было совершено покушение, но он не пострадал. Неизвестно, принимала ли Анна д'Эсте в организации нападения и последующем убийстве Гаспара де Колиньи в ночь святого Варфоломея в Париже.
5 мая 1566 года Анна д'Эсте снова вышла замуж. В Сен-Мор-де-Фоссе она обвенчалась с Жаком Савойским, герцогом Немюрским и Женевезским. В 1585 году, после смерти своего второго мужа, герцогиня жила, главным образом, в Париже, в Отель де Немюр. После создания Католической лиги, в которой её дети играли важную роль, Анна д'Эсте вернулась в политику. Но в декабре 1588 году король Генрих III был убит. В организации убийства обвинили её старших сыновей. Сама Анна д'Эсте была заключена в тюрьму, откуда была освобождена в феврале 1589 года.
Встав во главе Католической лиги, она была одним из главных действующих лиц в столице, осажденной войсками будущего короля Генриха IV, который после своего обращения в католичество и восхождения на трон, был признан ею королем. Анна д'Эсте провела последние годы жизни, служа суперинтендантом двора королевы Марии Медичи.
Она умерла 17 мая 1607 года в Париже. Сердце покойной герцогини похоронили в родовой гробнице де Гизов в Жуанвиле. Тело было перевезено в Аннеси и похоронено рядом со вторым мужем. На могиле Анны д'Эсте в течение года росли странные цветы и некоторые посетителям казалось, что они слышат голоса.