Родился 20 июня 1854 года в городе Итака. С детства был знаком с Луи Агассисом. Учился на врача, в 1872-1875 годах - в Корнелльском университете, в 1881 году окончил Нью-Йоркский гомеопатический медицинский колледж со степенью доктора медицины. В продолжение десяти лет занимался врачеванием в Бингемтоне до 1890 года и в Уэйверли до 1891 года.
В 1891 году Миллспо стал профессором ботаники в Университете Западной Виргинии. С 1894 года он работал куратором в Филдовском музее Чикаго. В 1895 году Чарльз Фредерик Миллспо был назначен профессором ботаники Чикагского университета, затем был доцентом экономической ботаники. В 1896 году он стал профессором медицинской ботаники в Чикагском гомеопатическом медицинском колледже.
В 1919 году Миллспо отправился на остров Санта-Каталина для восстановления после операции. В 1923 году он в соавторстве с Лоренсом Наттоллом выпустил монографию флоры этого острова.
Скончался Чарльз Фредерик Миллспо 15 сентября 1923 года.
Миллспо был членом Ботанического клуба Торри, Нью-Йоркского клуба исследователей, общества «Сигма Кси», Американской ассоциации по продвижению науки.