Родился в семье донских казаков. Рано лишился отца и матери. Остался с больной сестрой на руках и, чтобы как-то прокормиться, нанялся подмастерьем к сапожнику. По окончании школы поступил в Ростовское художественное училище. Окончив его, поехал в Ленинград, где поступил на искусствоведческий факультет Академии художеств. С третьего курса Академии ушёл добровольцем на фронт. Был простым солдатом-пехотинцем, воевал на Ленинградском и Волховском фронтах.
В 1951 году Министерство культуры выдвигает бывшего парторга Академии художеств Василия Пушкарёва на пост директора Русского музея. В то время Пушкарёву было всего 36 лет.
Поначалу он занимался восстановлением экспозиций музея, самая ценная часть которых в войну была вывезена в Пермь и Соликамск. С середины 1950-х годов стал собирать в запасниках музея картины русских художников, чьё творчество шло вразрез с официальным (партийным) взглядом на искусство. Среди собранного Пушкарёвым, (а в некоторых случаях и спасённого от исчезновения) - произведения Василия Кандинского, Казимира Малевича, Александра Тышлера и многих других. Особо в этом ряду стоит имя Павла Филонова, который в последние годы жизни не продал ни одной своей картины и умер от голода в блокадном Ленинграде. Его сестра, Евдокия Николаевна Филонова-Глебова, сама еле живая от голода, отдала тогда его картины на хранение в Русский музей. Через много лет после войны, в 1977 году, она официально передала в дар музею всё наследие художника.
Пушкарёв также помогал становлению молодых художников - например, в 1973 он организовал персональную выставку Василия Коноваленко, фактически открыв его художественному сообществу в качестве скульптора. Всего за свою жизнь Василий Пушкарёв собрал и сохранил примерно 120 тысяч произведений искусства.
С переездом в Москву в 1977 году, Пушкарёв возглавил Центральный дом художника на Крымском Валу, с 1991 года - директор Музея современного искусства.
Василий Пушкарёв умер в Москве 16 мая 2002 года. Его отпевали в церкви Николы в Толмачах на территории Третьяковской галереи, а гроб Пушкарёва стоял на том же месте, где прощались с Павлом Третьяковым.
Скандал с приездом Арманда ХаммераВ 1972 году в СССР приехал американский бизнесмен Арманд Хаммер, известный тем, что лично знал Брежнева и других советских генсеков. Бизнесмен принёс в дар Эрмитажу полотно Гойи и, хотя подлинность картины вызвала у экспертов сомнения, она была принята как настоящая. (По сей день это единственное полотно Гойи, выставленное в российских музеях). Взамен Хаммер просил дать ему одну из картин Малевича. Поскольку крупнейшее в стране собрание авангарда находилось в Русском музее, министр культуры Екатерина Фурцева позвонила Пушкарёву с просьбой отдать нужную картину. Но Пушкарёв отказался это сделать, сказав, что хозяин картин не он, а государство. В итоге полотно Малевича забрали из Третьяковской галереи. В тот раз Пушкарёва не сняли с работы, даже несмотря на то, что повёл он себя, по тем временам, дерзко. Спасло его во многом то, что через месяц после отъезда Хаммера журнал «Америка» напечатал статью, в которой говорилось о том, что бизнесмен «снова обманул Политбюро». Он заполучил полотно Малевича с минимальными для себя потерями, а затем продал его в Мюнхен за 4 миллиона долларов. Партийной верхушке было невыгодно быть замешанными в скандале, и об этой истории предпочли забыть.
Кроме того, в 1973 году (сразу после выставки в Русском музее, организованной Пушкарёвым) Хаммер намеревался купить 13 работ Василия Коноваленко, но ему отказали партийные чиновники.